Đặc tính probiotic của link w88 Lactobacillus gasseri SMH15 được phân lập từ sữa mẹ

TÓM TẮT:

Những năm gần đây, loài vi khuẩn lacticLactobacillus gasseriđã thu hút sự chú ý link w88 rất nhiều nhà khoa học trên thế giới do có những đặc tính sinh học quý. Nó đã được nghiên cứu, phát triển thành các sản phẩm thương mại, có mặt trên nhiều quốc gia. Những công bố gần đây cho thấy, vi khuẩn này có khả năng ức chế các vi khuẩn có hại, tăng cường chức năng miễn dịch và hỗ trợ tiêu hóa, nâng cao sức khoẻ con người.

Nghiên cứu đề cập đến các đặc tính sinh học quý link w88 chủng ký hiệu SMH15 được phân lập từ sữa mẹ link w88 người Việt Nam, đặc biệt là khả năng làm giảm cholesterol.

Từ khóa:Sữa mẹ,Lactobacillusreuteri, probiotic, giảm cholesterol.

1. Đặt vấn đề

Sữa mẹ được coi là nguồn dinh dưỡng thiết yếu và quan trọng cho sự phát triển link w88 trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Chúng chứa một lượng lớn các dưỡng chất cần thiết, các prebiotic và vi khuẩn có lợi cho trẻ sơ sinh [6, 9]. Sữa mẹ thường chứa 10³–10⁵CFU/ml vi khuẩn sống. Số lượng các lợi khuẩn trong sữa mẹ bị ảnh hưởng bởi các vi sinh vật trong đường ruột link w88 người mẹ. Chúng được vận chuyển bởi các tế bào gai đuôi và đại thực bào từ hệ thống bạch huyết thông qua các tuyến vú và trên bề mặt link w88 vú. [6]. Các loại vi khuẩn thường được phân lập từ sữa mẹ bao gồmBifidobacterium, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcuscũng nhưLactobacillus.Nhóm vi khuẩn lactic (LAB) nhưLactobacillus gasseri, L. fermentum, L. salivarius, Bifidobacterium longumsubsp.infantis, B. brevecó khả năng thúc đẩy sự xâm nhập link w88 nhóm vi khuẩn đường ruột và ngăn ngừa tiêu chảy [3].

LAB có nguồn gốc từ sữa mẹ và có tiềm năng sinh học lớn, do đó nó có khả năng tồn tại trong ruột cũng như có nguồn gốc từ chính con người. Các chủng thuộc loàiL. gasseritrong sữa mẹ được coi là những ứng viên sử dụng trong các sản phẩm sinh học thương mại khác nhau [9].Lactobacillus gasserilà một trong những loài chiếm ưu thế link w88 nhómLactobacillusvà được định nghĩa là vi sinh thuộc nhóm an toàn cấp 1 (GRAS) [3]. Hiện còn rất ít tài liệu công bố liên quan đến sự xuất hiện link w88Lactobacillustrong sữa mẹ ở Việt Nam. Vì vậy, nghiên cứu đưa ra các đặc điểm sinh học quý link w88 chủngLactobacillus gasseriSHM15 được phân lập từ sữa mẹ nhằm hướng tới việc sản xuất chế phẩm probiotics dành cho phụ nữ.

2. Nguyên liệu và phương pháp

2.1. Nguyên liệu

Chủng vi khuẩn lactic ký hiệu SMH15 được phân lập từ sữa mẹ trong nghiên cứu link w88 Hiền và cs [1]. Các chủng vi sinh vật kiểm định:Escherichia coliATCC 25922,Salmonella typhimuriumATCC 14028,Klebsiella pneumoniaeATCC 700603,Shigella flexneriATCC 12022,Haemophilus influenzaeATCC 49247,Pseudomonas aeruginosaATCC 27853,Staphylococcus aureusATCC 25923,Enterococcus faecalisATCC 33186,Streptococcus pneumoniaeATCC 49619,L. reuteriVTCC 910087,Candida albicansJCM 2070 được lưu giữ tại tại PTN Green Lab - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội.

Các hóa chất khác như môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kit tinh sạch DNA và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được sản xuất từ các hãng như Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Mỹ), Thermo Scientific (Mỹ), Anabio R&D (Việt Nam)…

2.2. Phương pháp

Phân lập và nuôi cấy Lactobacillus gasseri SMH15

Mẫu sữa mẹ được thu thập và xử lý theo nghiên cứu được mô tả chi tiết trong [1]. Sữa được pha loãng 10 lần trong dung dịch NaCl 0,15 M. Sau đó cấy trải 100 µL mẫu từ mỗi nồng độ pha loãng lên trên đĩa thạch MRS và đĩa thạch LBS. Các đĩa thạch này sau đó được ủ trong 48 - 72 giờ ở 37^oC, dưới điều kiện kị khí [1].

Phương pháp định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gen rRNA 16S

Khuẩn lạc riêng rẽ link w88 chủng SMH15 được tuyển chọn sử dụng để tách chiết ADN bằng Kit Anapure Bacterial DNA mini kit theo hướng dẫn link w88 nhà sản xuất (ANABIO R&D). [1].

ADN sau tinh sạch được dùng làm khuôn link w88 PCR khuếch đại đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu 27F: 5’-AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ và 1527R: 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ và chu trình nhiệt 95°C/10 phút - 30 chu kỳ 94°C/30 giây + 60°C/30 giây + 72°C/1 phút 30 giây - 72°C/5 phút - 4°C/∞. Băng có kích thước khoảng 1500bp được gửi đi1^stBASE DNA Sequencing Servicesđể giải trình tự DNA. Các trình tự ADN sau đó được phân tích bằng phần mềm Geneious Prime và so sánh với dữ liệu có sẵn trong ngân hàng gen link w88 NCBI (GenBank), sử dụng chương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỉ lệ tương đồng.

Xác định hoạt tính probiotic link w88 chủng vi khuẩn được tuyển chọn

Thử nghiệm an toàn (dựa vào khả năng không gây tan huyết)

Tính chất tan máu được thử nghiệm trên đĩa thạch Colombia chứa 5% (w/v) máu cừu (OR-BAK). Đĩa nuôi cấy được ủ trong 24 giờ ở 37°C và sau đó kiểm tra hoạt tính tan huyết. Sự hình thành các vùng sạch và xanh lục trên các đĩa được đánh giá là tan huyết. Không có khu vực xung quanh nên được xác định là tan máu γ (hoạt tính không tan máu) [3].

Khả năng sinh acid lactic

Độ axit tính theo độ Therner:^oT = V_NaOH _{tiêu tốn}x 10, % axit lactic =^oT x 0,009; trong đó:^oT là độ Therner, 1^oT tương ứng với 9 mg acid lactic [1, 3].

Khả năng chịu muối mật

Dựa theo phương pháp link w88 Colombo và cs (2018), đếm số lượng CFU/ml lúc 0 giờ và sau 4 giờ nuôi lắc ở 37^oC để xác định khả năng chịu muối mật link w88 chủng vi khuẩn được tuyển chọn [1, 3, 10].

Khả năng chịu acid

Đếm số lượng tế bào CFU/ml tại 0 giờ, 1 giờ và 3 giờ để xác định khả năng chịu acid link w88 chủng vi khuẩn được tuyển chọn [3, 10].

Khả năng nhạy cảm với kháng sinh

Các kháng sinh được sử dụng là: (C) Chloramphenicol 30 µg, (E) Erythromycin 15 µg, (TE) Tetracycline 30 µg, (CTX) Cefotaxine 30 µg, (AMP) Ampicillin 10 µg, (CN) Gentamicin 10 µg, (CIP) Ciprofloxacin 5 µg. Sử dụng khoanh giấy kháng sinh đặt trên môi trường đã cấy trải các chủng vi khuẩn nghiên cứu, đường kính vòng ức chế được đo sau khi ủ đĩa ở 37^oC trong 48 giờ [3].

Khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nấm có hại

Xác định khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nấm có hại bằng phương pháp đục lỗ thạch với các vi sinh vật kiểm định:S. aureusATCC 25923,E. coliATCC 25922 và nấmC. albicansJCM 2070. Quan sát đĩa thạch sau 24 - 48 giờ và đo đường kính vòng ức chế xung quanh lỗ thạch nếu có (D - d, mm; trong đó: D là đường kính vòng ức chế, mm; d là đường kính lỗ thạch, mm) [1, 3, 10].

Xác định hoạt tính chống oxy hoá:

Phương pháp kiểm tra hoạt tính 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Sau đó, các mẫu được đo bằng phép đo quang phổ ở OD517nm đối với DPPH [3, 10]. Khả năng trung hòa DPPH được so sánh với acid ascobic và được đánh giá theo công thức:

I% = 1 – (OD2/OD1)x100

Trong đó: OD1 (mật độ quang) và OD2 là độ hấp thụ link w88 chứng dương và mẫu.

Khả năng đồng hoá cholesterol

Hoạt tính giảm cholesterol link w88 chủng SMH15 được xác định bằng cách sử dụng phương pháp "o-phthalaldehyd" link w88 Asan-Ozusaglam, M., & Gunyakti, A., 2018, được mô tả theo tài liệu số [3]. Đồng hóa cholesterol được tính theo phương trình sau:

A% = 100 – (B/C)x100

Trong đó:

A: % Đồng hóa cholesterol,

B: Lượng cholesterol trong môi trường nuôi cấy (g),

C: Lượng cholesterol trong môi trường không được nuôi cấy (g).

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các kết quả được xử lý thống kê.

3. Kết quả

3.1. Đặc điểm phân loại chủng SMH15

Chủng SMH15 với khả năng sinh acid lactic cao (1,12 g/100ml) nên được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính probiotic ở điều kiệnin-vitro. Dựa vào kết quả giải trình tự gen 16S rRNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu trên GenBank, chủng SMH15 có độ tương đồng về trình tự gen 16S rRNA 99,8% với loàiLactobacillus gasseriATCC 33323 và 99,3% với chủngLactobacillus gasseriJCM 1131. Do đó, chủng này được đặt tên làLactobacillus gasseriSMH15với mã số được đăng ký trên Genbank là MT482753. Kết quả nghiên cứu về chủng SHM15 được trình bày ở Bảng 1.

Bảng 1. Đặc điểm link w88 chủngLactobacillus gasseriSMH15

3.2. Thử nghiệm an toàn

Hoạt tính tan huyết link w88 vi khuẩn acid lactic là một tiêu chí lựa chọn quan trọng trong các nghiên cứuin-vitrovà là một tính chất vô cùng cần thiết để đánh giá tính an toàn link w88 chủng. Theo quy định link w88 châu Âu, bất cứ chủng vi khuẩn lactic nào có khả năng làm tan máu (dạng b hay a) đều không được sử dụng làm probiotic cho người và vật nuôi. Trong nghiên cứu này, chủngL. gasseriSMH15 không thể hiện hoạt tính gây tan huyết, do đó chúng được coi là chủng an toàn.

Sự đề kháng kháng sinh (Bảng 2)

Bảng 2. Xác định khả năng nhạy cảm với kháng sinh

link w88 chủngL. gasseriSMH15

xac_dinh_kha_nang_nhay_cam_voi_khang_sinh_cua_chung_l-_gasseri_smh15

Thường các chủng LAB có xu hướng kháng lại một số kháng sinh nhóm aminoglycoside (amikacin, kanamycin, và gentamicin) và nhóm quinolone (nalidixic acid và ofloxacin) - khả năng kháng kháng sinh nội tại này là một đặc tính ưu việt và không có khả năng truyền ngang [4]. Mức độ đề kháng và nhạy cảm với kháng sinh được đánh giá theo giá trị tiêu chuẩn được đưa ra bởi CLSI. Kết quả thử khả năng nhạy cảm với kháng sinh link w88 chủngL. gasseriSMH15 cho thấy, chủng này nhạy cảm với kháng sinh chloramphenicol, erythromycin, tetracycline, ampicillin và kháng lại một số kháng sinh nhóm aminoglycoside: Cefotaxine, gentamicin; nhóm quinolone: Ciprofloxacin. (Bảng 2).

3.3. Khả năng chịu acid và muối mật

Khả năng sống sót trong điều kiện pH thấp link w88 dạ dày là một trong những tiêu chí quan trọng link w88 1 chủng probitic. Vì chỉ có đặc tính đó, vi khuẩn mới có thể tồn tại và nhân lên trong hệ tiêu hoá link w88 cơ thể vật chủ. Nghiên cứu thể hiện khả năng tồn tại link w88 SMH15 ở điệu kiện pH 2 và pH 3, trong 3 giờ (là thời gian tiêu hoá thức ăn).

Sự sống sót ở nồng độ muối mật khác nhau phụ thuộc vào đặc tính link w88 từng chủng. Kết quả thu được ở Hình 2 cho thấy, chủngL. gasseriSMH15 đều có thể sinh trưởng trong môi trường có chứa muối mật ở cả 2 nồng độ: 0,3% và 1%. Ở môi trường muối mật 0,3%, chủngL. gasseriSMH15 có thể tồn tại và tăng sinh khối sau 4 giờ nuôi cấy với mật độ tế bào tăng từ 8,15 log₁₀CFU/ml đến 8,45 log₁₀CFU/ml. (Hình 1)

Hình 1. Khả năng chịu acid (A) và muối mật (B)

link w88 chủngL. gasseriSMH15

Điều này ngược lại đối với môi trường muối mật 1%, chủngL. gasseriSMH15 sinh trưởng yếu hơn với mật độ tế bào giảm sau 4 giờ nuôi cấy từ 7,83 log₁₀CFU/ml xuống 7,34 log₁₀CFU/ml.

Tuy nhiên, sự giảm không đáng kể về mật độ tế bào link w88 chủngL. gasseriSMH15 dưới điều kiện muối mật 0,3% và 1% so với nhiều chủng khác đã công bố. Sự đề kháng với muối mật trong đường tiêu hóa là một yếu tố cần thiết để đánh giá về đặc tính probiotic link w88 chủng nghiên cứu [6, 9]. Thí nghiệm cho thấy, khả năng tồn tại link w88 chủngL. gasseriSMH15 ở các nồng độ muối mật khác nhau thích hợp để sử dụng làm chế phẩm sinh học.

3.4. Khả năng tự ngưng kết và đồng ngưng kết

Khả năng tự ngưng kết và đồng ngưng kết link w88 chủngL. gasseriSMH15 được xác định bằng đo quang phổ sau 4 giờ ủ. (Bảng 3)

Bảng 3. Khả năng đồng ngưng kết với 1 số chủng vi khuẩn gây bệnh

Kết quả cho thấy, khả năng tự ngưng kết link w88 chủng SMH15 được xác định khá cao với tỷ lệ 94± 3,6 %. Sự kết hợp link w88 chủng với các vi sinh vật kiểm định gây bệnh đã được ghi nhận trong khoảng từ 45 - 55% (Bảng 3). Chủng này thể hiện sự kết hợp cao nhất vớiE. coli(69 ± 3,4), trong khi đó sự kết hợp thấp nhất được xác định choStaphylococcus aureus(45 ± 1,9 %).

Đặc tính ngưng kết mạnh link w88 chủng vi khuẩn probiotic là rất quan trọng vì chúng giúp chủng này bám vào biểu mô ruột, tạo thành một rào cản và ngăn chặn sự xâm nhập link w88 các vi sinh vật gây bệnh trong đường ruột link w88 vật chủ [2]. Trong nghiên cứu này, chủng SMH15 với khả năng ngưng kết mạnh, cho phép xâm nhập và bám dính trong đường ruột link w88 vật chủ và gây ra một rào cản bằng cách ngăn chặn sự xâm nhập link w88 các vi sinh vật gây bệnh.

3.5. Khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nấm có hại

Hoạt tính kháng khuẩn là một yêu cầu thiết yếu đối với đặc tính probiotic link w88 một chủng vi khuẩn lactic. (Bảng 4)

Bảng 4. Khả năng ức chế đối với các vi khuẩn và nấm có hại

kha_nang_uc_che_doi_voi_cac_vi_khuan_va_nam_co_hai Kết quả ở Bảng 4 cho thấy, chủngL.gasseriSMH15 có khả năng ức chế 3 chủng vi khuẩn và nấm có hại làE. coli, S. aureusvà nấmC. albican.Khả năng ức chế đối với nấmC. albicansmạnh hơn hẳn so với 2 loài còn lại. ChủngL. gasseriSMH15 kháng lại cả 3 chủng vi sinh vật có hại được thử nghiệm làE. coliATCC 25922,S. aureusATCC 25923 và nấmC. albicansJCM 2070 (gây viêm nhiễm âm đạo). Kết quả này cũng trùng với nghiên cứu trước đây, LAB đã được chứng minh là ức chế sự tăng trưởngin-vitrolink w88 các vi sinh vật gây bệnh ở âm đạo như:B. fragilis, E. coli, G. vaginalis, Mobiluncusspp.,N. gonorrhoeae, P. anaerobius, P. bivia, S. aureusvàCandida[1].

3.6. Hoạt tính chống oxy hoá và khả năng đồng hóa cholesterol

Hiệu quả trung hoà gốc DPPH được ghi nhận là 39,20% đối với chủng SMH15. Trong nhiều công bố, hoạt động trung hoà gốc DPPH đã được báo cáo đối với các vi khuẩn acid lactic khác nhau. Ví dụ, khả năng trung hoà DPPH link w88L. helveticusvàL. paracaseitừ sữa lên men là 19,60% và 20,09%. Nghiên cứu cho thấy, chủng SMH15 với khả năng chống oxy hóa có thể có tác dụng chữa bệnh đối với sức khỏe link w88 vật chủ. Với khả năng này, chủng SHMH 15 có thể được đề xuất như một chất chống oxy hóa tự nhiên để ngăn chặn sự oxy hóa trong thực phẩm [5, 8].

Chủng SMH15 còn có khả năng đồng hóa cholesterol khi chất này được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Sau 24 giờ, với nồng độ 0,3% muối mật, khả năng đồng hóa cholesterol được xác định là 73,45% trong sinh khối và 77,3% ở dịch nổi. Ở nồng độ muối mật 1%, khả năng đồng hoá cholesterol trong sinh khối và dịch nổi là 51,33% và 75,66%, tương ứng. Mặc dù, hoạt động giảm cholesterol không được coi là một tiêu chí quan trọng nhưng đây được coi là một đặc điểm thú vị, ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe link w88 vật chủ. Trong một số công bố, khả năng giảm cholesterol link w88 vi khuẩn lactic phân lập từ sữa động vật thô, thực phẩm lên men, phô mai, phân bê và ruột link w88 cá biển trong phạm vi 8,4% - 43,5% [3, 7, 10]. Khả năng đồng hóa cholesterol link w88 chủng SMH15 cao hơn so với các nghiên cứu khác (trên 51%) [10]. Với khả năng làm giảm cholesterol, chủng SHM15 có thể được đề xuất như một thực phẩm chức năng bổ sung vào chế độ ăn uống và có thể được coi là một tác nhân trị liệu sinh học.

4. Kết luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy, chủngL. gasseriSMH15 có khả năng chịu được các điều kiện tương tự với đường tiêu hóa và cho tỷ lệ sống sót cao. Chủng này không chỉ sở hữu khả năng kháng khuẩn, khả năng chống oxy hóa mà còn có thể đồng hóa được cholesterol, do đó làm giảm cholesterol trong môi trường nuôi cấy. Vì thế,L. gasseriSHM15 có thể được coi là một chủng vi khuẩn probiotic có tiềm năng ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probioctic cho con người.

Lời cảm ơn:

Kinh phí thực hiện nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Đề tài mã số 12.19/CNSHCB thuộc Đề án Phát triển và Ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020, Bộ Công Thương.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Nguyễn Thanh Hiền, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Thị Việt Hà (2019),Đặc tính probiotic link w88 chủng Lactobacillus reuteri SMH2 phân lập từ sữa mẹ,Tuyển tập báo cáo toàn văn Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2019, trang 349-355.
Ammor, M. S., Flórez, A. B., & Mayo, B. (2007). Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and bifidobacterial.Food Microbiology, 24(6), 559-570.
Ayse Gunyakti, Meltem Asan-Ozusaglam (2019),Lactobacillus gasserifrom human milk with probiotic potential and some technological properties.Food Science and Technology109, 261- 269.
Casarotti, S. N., Carneiro, B. M., Todorov, S. D., Nero, L. A., Rahal, P., & Penna, A. L. B. (2017). In vitro assessment of safety and probiotic potential characteristics ofLactobacillusstrains isolated from water buffalo mozzarella cheese.Annals of Microbiology, 67(4), 289–301. Ding, W., Wang, L., Zhang, J., Ke, W., Zhou, J., Zhu, J., et al. (2017). Characterization of antioxidant properties of lactic acid bacteria isolated from spontaneously fermented yak milk in the Tibetan Plateau.Journal of Functional Foods, 35, 481–488. Fitzstevens J.L., Smith K.C., Hagadorn J.I., Caimano M.J., Matson A.P. and Brownell E.A. (2017), Systematic review of the human milk microbiota.Clin. Pract32,354- 364.
Gao, Y., & Li, D. (2018). Screening of lactic acid bacteria with cholesterol-lowering and triglyceride-lowering activity in vitro and evaluation of probiotic function.Annals of Microbiology, 68(9), 537-545.
Liu, C. F., Tseng, K. C., Chiang, S. S., Lee, B. H., Hsu, W. H., & Pan, T. M. (2011). Immunomodulatory and antioxidant potential ofLactobacillus Journal of the Science of Food and Agriculture, 91(12), 2284-2291.
Martín R., Langa S., Reviriego C., Jiménez E., Marín M.L., Xaus J., Fernández L. and Rodríguez J.M. (2003). Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut,Journal of Pediatrics, 143, 754-758.
Oh NS, Joung JY, Lee JY, Kim Y (2018). Probiotic and anti-inflammatory potential ofLactobacillus rhamnosus4B15 andLactobacillus gasseri4M13 isolated from infant feces.PLoS One.13: e0192021.

PROBIOTIC CHARACTERISTICS OFlactobacillus gasseriSMH15 STRAIN ISOLATED FROM BREAST MILKOF VIETNAMESE WOMEN

Phan Thuy Duong^{1, 2}, Le Phung Hien^1,2, Nguyen Thi Xuan^1,2,

Ph.D. Tran Thi Thanh Huyen², Ph.D. Mai Thi Dam Linh²,

Ph.D. Pham Thanh Hien², Asocc. Ph.D. Nguyen Thi Van Anh³,

Asocc. Ph.D. Bui Thi Viet Ha^1,2,3

Center for life Science research, VNU University of Science¹

Faculty of Biology, VNU University of Science²

The Key Laboratory of Enzyme & Protein Technology,

VNU University of Science³

ABSTRACT:

In recent years, lactic acid bacteriaLactobacillus gasserihas drawn great attention of many scientists around the world due to its valuable biological properties and it has been developed into commercial product in many countries. Many recent published studies show that this bacterium has the ability to inhibit harmful bacteria, enhance immune function and aid digestion, and improve human health. This study examines the precious biological properties of SMH15 strain isolated from breast milk of Vietnamese women, especially the ability to reduce cholesterol.

Keywords: Breast milk,Lactobacillusreuteri, probiotic, reduce cholesterol.